一、 什么是PCR實(shí)驗室

PCR 是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱(chēng)。聚合酶鏈式反應也可以 當作一項極其重要的酶促合成 DNA 技術(shù)。PCR 又稱(chēng)為無(wú)細胞克隆系統或特異性 DNA 序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術(shù)的一次重大革新，它可將極微量的靶 DNA 特異地擴增上百萬(wàn)倍。聚合酶鏈反應（PCR）是在 DNA 聚合酶催化下，以母鏈 DNA 為模板以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板 DNA 互補的子鏈 DNA 的過(guò)程。是 一項 DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目的 DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達調控，基因多態(tài)性研究等許多方面。一對合成 DNA 的引物經(jīng)過(guò)高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區段的基因拷貝數放大一倍,一般樣品是經(jīng)過(guò) 30 次循環(huán),最終使基因放大了數百萬(wàn)倍; 將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴增特異區段的 DNA 帶。

二、PCR實(shí)驗室設計原則（以非洲豬瘟檢測PCR實(shí)驗室為例）：

1、非洲豬瘟檢測實(shí)驗室的選址：

   符合國家檢測實(shí)驗室的相關(guān)規定，具體適用于屠宰場(chǎng)來(lái)說(shuō)，可選擇辦公樓或者獨立的實(shí)驗室空間，選址絕對不能和屠宰線(xiàn)相通，如果實(shí)驗室陽(yáng)性對照污染，會(huì )污染整個(gè)屠宰生產(chǎn)線(xiàn)，勢必對屠宰場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟損失。

   個(gè)別不專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗室設計建造公司因為不了解非洲豬瘟檢測實(shí)驗室的檢測流程，造成設計布局不合理，對后期開(kāi)展工作造成很大的不便及生物安全隱患。

2、主體結構：

   目前實(shí)驗室的主體多為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽(yáng)角均采用鋁合金R50內角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問(wèn)題。并且彩鋼板結構牢固，線(xiàn)條簡(jiǎn)明，美觀(guān)大方，密封性好。

3、標準的四區分隔和氣壓調節：

   將 PCR 過(guò)程分成試劑準備、標本制備和 PCR 擴增區及產(chǎn)物分析檢測區四個(gè)獨立的實(shí)驗區。整個(gè)區域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨立實(shí)驗區設置有緩沖區，同時(shí)各區通過(guò)氣壓調節， 使整個(gè) PCR 實(shí)驗過(guò)程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

另外：

   PCR 實(shí)驗室根據使用儀器的功能合理設置各個(gè)工作區域，如采用聚合酶聯(lián)反應：則設置試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增區、擴增產(chǎn)物分析區四個(gè)單獨的工作區域，這是最常用的分區方式。樣品需要粉碎處理的，還需增設樣品粉碎區；若使用實(shí)時(shí)熒光 PCR 法：基因擴增區、基因產(chǎn)物分析區可以合并在一個(gè)房間內；采用標本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的全自動(dòng)化 PCR 分析儀，則標本制備區、擴增區、擴增產(chǎn)物分析區可合并為一個(gè)區域，因此 PCR 實(shí)驗室原則上設置五個(gè)區或四個(gè)區或三個(gè)區或二個(gè)單獨的工作區。

  核酸擴增前區和核酸擴增后區可設在一個(gè)房間內，但必須在滿(mǎn)足下列要求的前提下：

a. 核酸擴增前區實(shí)驗室內設置兩個(gè)不同位置的實(shí)驗區，試劑配置在超凈工作臺中操作，樣品處理在生物安全柜內操作。

b. 在核酸擴增后區使用全封閉的擴增和檢測系統，如實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀等。

c. 每個(gè)實(shí)驗人員使用各自的試劑、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。

d. 在實(shí)驗前后對操作區域和共享器具進(jìn)行清潔及消毒。

e. 各區域的試劑、器具、儀器和設備為該區專(zhuān)用，不得交叉使用。

4、非洲豬瘟檢測實(shí)驗室的布局：

非洲豬瘟檢測實(shí)驗室用的儀器為熒光定量PCR，因此核酸擴增和分析在一個(gè)區，實(shí)驗室設計需要如下功能房間：PCR緩存走廊、帶緩存間的配液室、帶緩存間的樣品處理室、帶緩存間的核酸擴增分析區及實(shí)驗室用具消毒室。

5、非洲豬瘟檢測實(shí)驗室生物安全保護：

理論上講非洲豬瘟檢測實(shí)驗室是BSL-2 生物安全實(shí)驗室，需要配置二級生物安全柜，推薦選擇70%外排，30%內循環(huán)，各功能房間緩存設置更衣柜和消毒器，各區的實(shí)驗服專(zhuān)用，物料流通需要配置帶紫外線(xiàn)的互鎖的傳遞窗，實(shí)行人流物流分開(kāi)設置。

6、非洲豬瘟檢測實(shí)驗室消毒：

在三個(gè)實(shí)驗區和三個(gè)緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。

在試劑準備區和標本制備區還設置移動(dòng)紫外線(xiàn)燈，對實(shí)驗桌進(jìn)行局部消毒。

7、非洲豬瘟檢測實(shí)驗室機械連鎖不銹鋼傳遞窗：

試劑和標本通過(guò)機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過(guò)程中不受污染（人物分流）。

8、非洲豬瘟檢測實(shí)驗室地面

地面建議使用 PVC 卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒(méi)有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少 800mm×800mm）接縫需要小于 2mm。

9、非洲豬瘟檢測實(shí)驗室照明

燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。

三、空氣流與壓差要求

PCR 實(shí)驗室的空氣流向必須嚴格按照試劑儲存和準備區→標本制備區→擴增區→擴增產(chǎn)物分析區空氣壓力逐漸遞減方式進(jìn)行，防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴增前的區域。風(fēng)速流向不得混亂。

為了保證房間內的壓差和避免污染，應在空調面板處寫(xiě)清楚送風(fēng)機和排風(fēng)機的開(kāi)啟順序和關(guān)閉順序，先后順序不得混亂。

空氣潔凈級別不同的相鄰房間之間的靜壓差應大于 5 帕，潔凈室(區)與室外大氣的靜壓差應大于 10 帕，應配備監測靜壓差的設備，并定期監控。

一般情況下，試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；可以通過(guò)控制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達到正壓效果。

核酸擴增室及產(chǎn)物分析室應呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品，可以通過(guò)控制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達到負壓效果。

在理想情況下，PCR 實(shí)驗室緩沖間內，可設置正壓，使室內空氣不流向室外，室外空氣不流向室內。PCR實(shí)驗室進(jìn)風(fēng)由原有中央空調控制的要求將中央空調風(fēng)口安裝到指定定點(diǎn)。

四、實(shí)驗室設施要求：

實(shí)驗室基礎設施設計：包括實(shí)驗室基礎裝修、實(shí)驗室凈化工程、實(shí)驗室供排水工程、實(shí)驗室電路系統。

1）實(shí)驗室基礎裝修需要潔凈天花、地板、隔斷，合理設置緩存間及配置凈化門(mén)、觀(guān)察窗、傳遞窗等。

2）實(shí)驗室凈化工程 實(shí)驗室應配備單獨送排風(fēng)設施，試劑配置區、核酸提取區和擴增分析區應配備凈化系統。

3）實(shí)驗室供排水工程包括非手動(dòng)水龍頭、不銹鋼或PP水池和緊急淋浴器及供排水管線(xiàn)管路。

4）實(shí)驗室電路系統:根據儀器的功率配置合適的功率，特別注意高壓滅菌鍋的功率，注意實(shí)驗室用電安全。

5）配備適用的應急器材，如應急照明設備、消防器材、意外事故處理器材等。

五、實(shí)驗室儀器及設備

1）更衣室儀器及設備：更衣柜或掛衣架、鞋柜以及消毒器和烘干器。

2）配液室儀器及設備：國鉉超凈工作臺、冰箱、小型離心機、旋渦振蕩器、微量移液器等。

3）樣品處理室儀器及設備：離心機、組織研磨機、Ⅱ級生物安全柜、恒溫水浴鍋、冰柜等、可移動(dòng)紫外消毒器。

4）核酸提取室儀器及設備：核酸提取儀、Ⅱ級生物安全柜、恒溫水浴鍋、小型離心機、微量移液器、可移動(dòng)紫外消毒器等。

5）擴增分析區儀器及設備：熒光定量PCR儀、電腦、打印機、不間斷電源、可移動(dòng)紫外消毒器等。

6）消毒洗滌室：高壓滅菌器、干燥箱、器皿柜等。

六、實(shí)驗室面積及設備間距

一般來(lái)說(shuō)各房間的面積沒(méi)有嚴格要求，只需能放置所需儀器設備，并且便于人員操作即可，但是有生物安全柜的房間面積不能小于10平米，并且每增加一臺生物安全柜，房間就要增加 10 平米。各實(shí)驗室緩沖間的面積一般為 1300*（1300 或 1500）mm 為宜，并且緩沖間的面積不能 大于實(shí)驗室房間面積的 1/8。

在做平面設計的時(shí)候，首先要考慮的因素是就是“安全”，實(shí)驗室是最易發(fā)生爆炸、火災、毒氣泄露等的場(chǎng)所。我們在做平面設計的時(shí)候，應盡量地要保持實(shí)驗室的通風(fēng)流暢、逃生通道暢通。根據國際人體工程學(xué)的標準。

我們做如下的劃分以供參照：

實(shí)驗臺與實(shí)驗臺通道劃分標準(通道間隔用 L 表示)

L>500mm 時(shí)，一邊可站人操作；

L>800mm 時(shí)，一邊可坐人操作；

L>1200mm 時(shí)，一邊可坐人，一邊可站人，中間不可過(guò)人;

L>1500mm 時(shí)，兩邊可坐人，中間可過(guò)人；

L>1800mm 時(shí)，兩邊可坐人，中間可過(guò)人可過(guò)儀器

天平臺、儀器臺不宜離墻太近，離墻 400mm 為宜。為了在工作發(fā)生危險時(shí)易于疏散，實(shí)驗臺間的過(guò)道應全部通向走廊。另:實(shí)驗室建筑層高宜為 3.7 米-4.0 米為宜，凈高宜為2.7米-2.8 米，有潔凈度、壓力梯度、恒溫恒濕等特殊要求的實(shí)驗室凈高宜為 2.5 米-2.7 米（不包括吊頂）；實(shí)驗室走廊凈寬宜為 2.5 米-3.0 米.普通實(shí)驗室雙門(mén)寬以 1.1 米-1.5 米(不對稱(chēng)對開(kāi)門(mén))為宜,單門(mén)寬以 0.8 米-0.9 米為宜。

七、潔凈裝修要求

潔凈室（區）的內表面應平整光滑、無(wú)裂縫、接口嚴密、無(wú)顆粒物脫落，并能耐受清洗

和消毒，墻壁與地面的交界處宜成弧形或采取其他措施，以減少灰塵積聚和便于清潔。

潔凈室(區)內各種管道、燈具、風(fēng)口以及其他公用設施，在設計和安裝時(shí)應考慮使用中

避免出現不易清潔的部位。

潔凈室(區)的窗戶(hù)、天棚及進(jìn)入室內的管道、風(fēng)口、燈具與墻壁或天棚的連接部位均應

密封。

八、人流路徑與物流路徑

進(jìn)入實(shí)驗室區域工作人員應該按照以下路徑：

公共清潔區——更衣間（更換潔凈服）——緩沖間——污染實(shí)驗區

工作人員退出實(shí)驗室的路徑為：

污染試驗區——緩沖間——淋浴間（有條件的可設置）——更衣間——公共清潔區

所有的物品進(jìn)入實(shí)驗區必須經(jīng)過(guò)雙扉互鎖傳遞窗，利用傳遞窗消毒后才可進(jìn)入，實(shí)驗室

內所有物品的也必須經(jīng)過(guò)傳遞窗才可以傳遞到實(shí)驗室以外的清潔公共區。

門(mén)的開(kāi)啟方向

實(shí)驗室建筑層高宜為 3.7 米-4.0 米為宜，PCR 實(shí)驗室凈高宜為 2.5 米-2.7 米（不包括吊頂）；實(shí)驗室走廊凈寬宜為 2.5 米-3.0 米.普通實(shí)驗室雙門(mén)寬以 1.1 米-1.5 米(不對稱(chēng)對開(kāi)門(mén))為宜,單門(mén)寬以 0.8 米-0.9 米為宜。

一般實(shí)驗室門(mén)主要向里開(kāi)，但如有危險的房間，房門(mén)應朝外開(kāi)，房門(mén)材質(zhì)最好選擇壓力

玻璃。

有壓差梯度的房間，門(mén)的開(kāi)啟方向應朝向正壓方向一側開(kāi)啟；

考慮到消防安全，對于那些主要逃生門(mén)的開(kāi)啟方向應朝向清潔區方向開(kāi)啟。

九、工作服要求

在凈化車(chē)間內工作的人員應穿著(zhù)符合要求的工作服。工作服的選材、式樣及穿戴方式應與生產(chǎn)操作和空氣潔凈度級別要求相適應，并不得混用。潔凈工作服的質(zhì)地應光滑、不產(chǎn)生靜電、不脫落纖維和顆粒性物質(zhì)。無(wú)菌工作服必須包蓋全部毛發(fā)、胡須及腳部，并能阻留人體脫落物。不同空氣潔凈度級別使用的工作服應當分別清洗、整理，必要時(shí)消毒或滅菌。工作服洗滌、滅菌時(shí)不應帶入附加的顆粒物質(zhì)。工作服應制定清洗周期。

進(jìn)入各個(gè)區域必須嚴格按照單一方向進(jìn)行，不同的工作區域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開(kāi)時(shí)，不得將工作服帶出。

實(shí)驗室應建立、執行人員進(jìn)出潔凈區的清潔程序和管理制度，人員清潔程序合理。

十、人員培訓

配備至少兩名專(zhuān)業(yè)實(shí)驗員，能夠獨立處理樣品、提取核酸及核酸擴增，熟練掌握超凈工作臺、生物安全柜、自動(dòng)提取儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的使用，加強生物安全方面的培訓，避免實(shí)驗室污染。

附：非洲豬瘟檢測實(shí)驗室要求參考

一、非洲豬瘟

   非洲豬瘟（African swine fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，臨床上以高熱、網(wǎng)狀內皮系統出血和高死亡率為特征，易感豬群的病死率高達100%。世界動(dòng)物衛生組織（OIE）將其列為法定報告動(dòng)物疫病，我國將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。目前，針對非洲豬瘟防控，尚無(wú)有效的商品化疫苗，防控重點(diǎn)是做好生物安全管理和早期診斷撲殺凈化。

二、非洲豬瘟感染規律

   源于：《FAO動(dòng)物生產(chǎn)與衛生手冊——非洲豬瘟：發(fā)現與診斷》

   ASF自然感染潛伏期為4-19天。

   最急性和急性感染通常在4-10天死亡。

   在臨床癥狀出現的2天前，ASF感染動(dòng)物開(kāi)始散播大量病毒。

   感染后7-9天血清轉陽(yáng)，抗體持續很長(cháng)時(shí)間，可持續終生。

三、非洲豬瘟檢測實(shí)驗室設備儀器配置方案

   用于非洲豬瘟病毒檢測的實(shí)驗室，推薦配置以下設備：II級生物安全柜、混勻儀（渦旋振蕩器）、高速離心機、金屬浴或恒溫水浴鍋、組織破碎儀（均質(zhì)器/勻漿儀）、移液器、冷藏冷凍冰箱、高壓滅菌鍋。同時(shí)，建議實(shí)驗室配備合適的個(gè)人防護用品，如防護服、手套、口罩等。

    1. II級生物安全柜：提供無(wú)菌環(huán)境用于處理組織樣品等（避免外部環(huán)境污染樣品），同時(shí)保證病毒不向實(shí)驗室環(huán)境擴散（保證人員和環(huán)境安全）。

    2.高速離心機：用于血清的分離和樣品的處理的分離。

    3. 金屬浴或恒溫水浴鍋：提供恒溫環(huán)境，用于樣品處理過(guò)程中的裂解過(guò)程。建議選擇帶有震蕩功能的設備，或者配備單獨的混勻儀（渦旋振蕩器）。

    4.組織破碎儀（均質(zhì)器/勻漿儀）：根據樣品類(lèi)型選擇便攜式組織破碎儀或者高通量組織破碎儀等（在用組織檢測時(shí)使用）。

    5. 移液器：用于實(shí)驗過(guò)程中的微量體積加樣。

    6.冷藏冷凍冰箱：用于樣品、試劑盒試紙等儲存，建議定期監測冰箱溫度。

    7.高壓滅菌器：用于實(shí)驗結束后樣品及用具的滅菌處理，避免樣品帶有病毒時(shí)泄露導致疫情擴散。